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山輕(山東)環(huán)保設計院有限公司

寧波正揚生物病毒檢測注意事項

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根據(jù)現(xiàn)有法規(guī)和指導原則可以發(fā)現(xiàn),RCL病毒檢測方法主要包含指示細胞培養(yǎng)法、ELISA法、PCR/q-PCR法和PERT法。因為指示細胞培養(yǎng)法檢測需28天,并且因為陽性對照病毒的性質(zhì),要求其需要在P3或者P2實驗室環(huán)境中進行,致使該方法具有耗時長,環(huán)境要求高的特點。相比而言,基于VSV-G序列的q-PCR方法或基于psi-gag序列的PCR方法,因其具有檢測時間短、環(huán)境條件簡單、靈敏度高和可重復性強等優(yōu)點,被許多CAR-T申報企業(yè)作為快速放行方法。歡迎聯(lián)系重組腺相關病毒檢測。寧波正揚生物病毒檢測注意事項

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基因治 療產(chǎn)品是近年來國內(nèi)外藥物研發(fā)的熱點,通常由各種病毒或非病毒載體攜帶治 療基因組成。在病毒載體中,慢病毒載體(LVs)由于其有效的將基因整合進靶細胞基因組、穩(wěn)定的基因表達等特點,被認為是蕞有希望的基因治 療載體。考慮到慢病毒對人的病原性及相關的安全性,所使用的慢病毒載體均為復制缺陷型載體,但在病毒載體生產(chǎn)過程中可能由于同源重組或非同源重組導致可復制性慢病毒(RCL)的產(chǎn)生,RCL可以整合到細胞基因組中,從而導致原ai基因激 活,抑ai基因破壞等,因此,這類產(chǎn)品中的復制型慢病毒檢測是安全性檢測中非常重要的項目,美國FDA及中國CDE都要求在生產(chǎn)的整個過程及不同階段都要進行RCL檢測,以確保無RCL的污染。上海重組腺相關病毒檢測常見問題復制型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測要求有哪些?

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美國FDA要求對于采用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體的產(chǎn)品,需要在整個生產(chǎn)過程及不同階段進行RCR復制型逆轉(zhuǎn)錄病毒/RCL復制型慢病毒檢測,針對載體生產(chǎn)用主細胞庫、工作細胞庫、生產(chǎn)終末細胞、載體上清液及在體外培養(yǎng)超過4天的載體轉(zhuǎn)到細胞進行檢測。針對慢病毒載體使用時RCL的檢測,除了金標準——指示細胞培養(yǎng)法,還需要選擇2種不同原理的快檢方法對其進行補充檢測。RT-PCR法具備操作便捷快速、特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,是RCR/RCL補充檢測的優(yōu) 選方法。

目前針對RCL復制型慢病毒檢測的方法差異很大,例如,實時定量PCR方法(Q-PCR法)會因為細胞或質(zhì)粒DNA殘留導致假陽性;合胞體形成測定法需要慢病毒具有完整的能力并且包含Env元件,該方法的靈敏度還未得到驗證;標志物補救測定法尚不清楚來自載體生產(chǎn)過程中的RCL是否會濟活標志物;逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT)不能區(qū)分RCL和載體顆粒,且細胞中固有的內(nèi)源性 病毒顆粒也會影響檢測結(jié)果的判斷;細胞培養(yǎng)法檢測時間過長。如您有需要,歡迎聯(lián)系!為什么要做復制型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測?

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RCL復制型慢病毒檢測方法包括以下3種:①ELISA法(p24蛋白測定):適用于由載體生產(chǎn)過程中病毒基因組之間的重組形成RCL的檢測。但,對于VSV-G包膜質(zhì)粒和來源于其他病毒的gal-pol基因功能組件之間發(fā)生重組不表達p24蛋白的假型病毒不適用。其優(yōu)點為適用性廣(濃縮載體、終末細胞、血清血漿等多種樣本)、靈敏度高和可定量等。②使用qPCR的方法測定VSV-G基因和PCR方法檢測由病毒載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒重組產(chǎn)生的psi-gag基因序列,具有靈敏度高,可重復性和操作簡單等優(yōu)點。③測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的方法,它可以用來檢測RCL相關的不同結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)病毒,缺點為在某些細胞檢測中,存在背景高的現(xiàn)象。慢病毒檢測助力CAR-T細胞醫(yī)治產(chǎn)品質(zhì)控放行。杭州RCR病毒檢測價格

CAR-T細胞醫(yī)治產(chǎn)品中復制型慢病毒檢測的監(jiān)管要求。寧波正揚生物病毒檢測注意事項

qPCR法RCL/RCR病毒檢測:目前許多CAR-T企業(yè)采用Q-PCR方法直接測定CAR-T終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi-gag序列,因考慮到CAR-T細胞種產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況,基于細胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測方法周期較長,建議在細胞產(chǎn)品制備過程中進行多面控制(如對慢病毒載體及生產(chǎn)終末細胞采用基于細胞培養(yǎng)方法測定RCL/RCR,以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風險),細胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR檢測法快速放行。qPCR法RCL/RCR病毒檢測:目前許多CAR-T企業(yè)采用Q-PCR方法直接測定CAR-T終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi-gag序列,因考慮到CAR-T細胞種產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況,基于細胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測方法周期較長,建議在細胞產(chǎn)品制備過程中進行多面控制(如對慢病毒載體及生產(chǎn)終末細胞采用基于細胞培養(yǎng)方法測定RCL/RCR,以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風險),細胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR檢測法快速放行。。寧波正揚生物病毒檢測注意事項

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